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細跑凍存與復(fù)蘇注意事項

發(fā)布時間: 2024-01-24  點擊次數(shù): 311次

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,利用凍存技術(shù)將細胞冷凍保存在-196C℃液氮中,可以使細胞暫時停止生長并保留細胞特性,以便在需要時再復(fù)蘇細胞用于實驗。同時保存適量的細胞,可以防止細胞在培養(yǎng)過程中因受到污染或其他意外事件導(dǎo)致細胞丟種,起到細胞保種的作用。

一、冷凍"慢條斯理",復(fù)蘇“眼疾手快"

細胞凍存和復(fù)蘇采取"慢凍快融"的原則,慢速冷凍可使細胞內(nèi)的水份滲出細胞外,減少細胞內(nèi)形成冰晶的機會;快融以保證細胞外結(jié)晶快速融化,避免慢速融化水份滲入細胞內(nèi),再次形成胞內(nèi)冰晶造成對細胞的損傷。

二、“高高M興上班,平平安安回家"

細胞凍存時需向培養(yǎng)基中加入冷凍保護劑,可保護細胞在冷凍時免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑可根據(jù)其是否穿透細胞膜分為滲透性和非滲透性兩類:

1、滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內(nèi),一般是一些小分子物質(zhì),主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

2、非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內(nèi),一般是些大分子物質(zhì),主要包括蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。

三、細胞凍存的“按部就班"

1、準備已滅菌的凍存培養(yǎng)液,并4℃預(yù)冷;

2、選取對數(shù)生長期的細胞,棄掉細胞培養(yǎng)液,用細胞消化酶(如胰蛋白酶)進行消化,適時去掉消化液,加入少量新鮮培養(yǎng)液。懸浮生長的細胞不進行消化處理,直接將細胞收集于離心管中離心,1000 rpm,5-10 min;

3、棄去上清液,逐漸加入適量預(yù)冷的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數(shù),調(diào)節(jié)細胞濃度在5×106~1×107/mL之間;

4、將上述細胞分裝于2 mL凍存管中,每管1-1.5 mL。在凍存管上標明細胞名稱、凍存日期和操作者;

5、凍存∶標準的降溫速率開始為-1~-2C/ min,當溫度降到-8O℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20°℃冰箱2h,然后放入-80°℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。

四、細胞復(fù)蘇的“按部就班"

1、從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃水浴中,并不時搖動使其盡快融化;

2、從37C水浴中取出凍存管,在無菌條件下取出細胞,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻,以1000 rpm,5-10min離心;

3、棄去上清液,加入適量培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù),調(diào)整細胞密度后接種到培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);4、次日更換—次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。

五、前方高能預(yù)警

1、配制好的細胞凍存液要進行預(yù)冷,新鮮配制的凍存液會產(chǎn)生大量的熱。

2、凍存的細胞在半年后,建議取出一只凍存管細胞復(fù)蘇培養(yǎng),觀察生長情況,然后再繼續(xù)凍存。


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